Des bactéries transgéniques productrices d'insuline (corrigé)

Les manipulations nécessaires à la transgénèse réussie réalisée ici peuvent réparties en 3 étapes successives:

1. L'obtention du gène de l'insuline humaine

Cette étape n'est pas documentée ici mais pour ce que nous savons de l'insuline, sécrétée par les cellules ß des îlots de Langerhans du pancréas, après le cours de 1ère S sur la glycémie, cela n'a pas du être facile. En effet, l'insuline est une protéine de 51 aa qui comporte deux chaînes (21 et 30 aa respectivement) réunies par des ponts disulfure. Le peptide, car ce n'est pas une protéine au sens strict (c'est un polypeptide de moins de 100 aa et de moins de 10.000 daltons puisque son poids moléculaire est de 5733 daltons, du moins pour l'insuline bovine car je n'ai pas le chiffre pour l'insuline humaine, mais il n'y a que quelques aa de différents), est synthétisé sous forme d'un long peptide de 86 aa, la proinsuline, qui est scindée dans l'appareil de Golgi en insuline et en peptide C de 35 aa. Le gène de l'insuline humaine est morcelé en unités codantes et non codantes et le premier ARNm messager transcrit subit une maturation complexe.
Nous reviendrons sur les caractéristiques de ce gène dans la dernière partie.

2. L'insertion du gène "humain" dans un vecteur d'insertion et sa multiplication: le plasmide pBR322 d'Escherichia coli.

Le plasmide bactérien pBR322 est isolé d'Escherichia coli (document 1). Il possède deux caractéristiques essentielles qui en font un vecteur idéal:

• il possède un seul site de restriction pour une enzyme (pstI) qui est situé au milieu d'un gène de résistance à un antibiotique (l'ampicilline). On peut donc utiliser cette enzyme de restriction (pstI) pour insérer le gène de l'insuline humaine qui aura été isolé du génome humain à l'aide de la même enzyme de restriction. L'utilisation de la même enzyme de restriction permettant d'assurer la présence d'extrémités cohésives qui permettent, dans le meilleur des cas la formation de plasmides recombinés (ou chimères), ayant intégré le gène de l'insuline humaine au milieu de leur gène de résistance à l'ampicilline. La position du site de restriction au sein d'un gène de résistance à un antibiotique permet de réaliser facilement le criblage des transformants, c'est-à-dire le tri des plasmides ayant intégré le gène humain (plasmides recombinés ou chimères ou transformants). En fait ce criblage ne se fait pas sur les plasmides mais sur les souches d'Escherichia coli ayant intégré un plasmide. Il y a donc une étape supplémentaire d'insertion du vecteur (transformé ou non) dans des cellules vivantes bactériennes qui constituent l'organisme multiplicateur (phase de multiplication). Le plasmide pBR322 constitue un vecteur d'insertion (du gène dans un organisme vivant) et Escherichia coli, avec son plasmide transformé, constitue le vecteur de multiplication. On réalise UNE RÉPLIQUE (technique des empreintes sur velours, document 2) sur un milieu contenant l'antibiotique (ampicilline) et les souches qui ne se développent pas sont les souches qui n'ont PAS intégré le gène "humain". On peut donc les repérer sur le milieu de culture original et les cultiver séparément. On a donc une souche d'Escherichia coli qui a intégré, dans son cytoplasme, un plasmide pBR322* recombiné (porteur du gène de l'insuline humaine).
• il possède un autre gène de résistance à un autre antibiotique (la tétracycline, document 1). L'intérêt de la présence d'un autre gène de résistance permet de travailler sur des milieux de culture enrichis avec cet antibiotique et donc de ne permettre le développement que de souches résistantes. On empêche ainsi le développement de souches "parasites" extérieures qui contamineraient le milieu de culture. (Document 2)

3. L'expression du gène inséré

Cette étape n'est qu'évoquée à la fin du document 2. Du fait de sa complexité et de son caractère partiellement secret, au moins du point de vue des techniques d'obtention, cette étape n'est pas à proprement parler scientifique (la science nécessite la communication à la communauté scientifique des résultats en vue d'une reproduction). Un gène comprend des séquences de régulation qu'il a fallu trouver et insérer en amont du gène humain. Des séquences plasmidiques et bactériennes on été utilisées. La souche bactérienne génétiquement modifiée (OGM) a été brevetée et est exploitée. Elle libère directement l'insuline dans le milieu de culture d'après mes souvenirs.
La réussite (aussi médicale, ou tout au moins pharmaceutique) qui a couronné des années de recherche (coûteuses) a permis, dans ce cas particulier, un retour sur investissement annonciateur d'autres succès, au dire de ses partisans.
La présentation simplifiée que nous avons faite ici du génie génétique ne montre pas forcément tous les aléas de cette technique coûteuse.

retour cours